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技術(shù)服務(wù)
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亞細(xì)胞定位
亞細(xì)胞定位
亞細(xì)胞定位技術(shù)服務(wù)
亞細(xì)胞是生物學(xué)中描述比完整細(xì)胞更微觀的結(jié)構(gòu)層級，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、以及諸如線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、液泡等細(xì)胞器。蛋白質(zhì)必須處于合適的亞細(xì)胞位置才能發(fā)揮其功能，了解蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位對于揭示它們的功能、參與的生物學(xué)過程以及與其他分子的相互作用至關(guān)重要。
亞細(xì)胞定位研究可先對氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，再結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)、免疫熒光標(biāo)記及Xenium空間分析等方法，是揭示分子功能、細(xì)胞活動機(jī)制的核心手段。
浦芥生物提供的亞細(xì)胞定位技術(shù)服務(wù)先對目標(biāo)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，再將熒光蛋白（如GFP、YFP、RFP等）與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，通過瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)或者遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，使得融合蛋白在受體材料細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，目標(biāo)蛋白會牽引熒光蛋白一起定位到目標(biāo)細(xì)胞器，利用激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下簡稱激光共聚焦顯微鏡）觀察熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)顯示的位置，從而確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。在此基礎(chǔ)上，浦芥生物提供多種共定位服務(wù)，轉(zhuǎn)入一個Marker載體，可以明確目標(biāo)蛋白具體的定位信息，相比于普通亞細(xì)胞定位，共定位得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確。
我們的技術(shù)優(yōu)勢
? 高精度成像系統(tǒng)：共聚焦顯微鏡 + 超分辨率成像（分辨率達(dá)0.1μm），無需額外的標(biāo)記或處理步驟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀和易于理解。
? 多標(biāo)記兼容性：支持4通道同步標(biāo)記（如EGFP/mEmerald(超強(qiáng)綠色熒光)/EYFP/CFP/ RFP/mCherry/DAPI等）
? 高表達(dá)量的亞細(xì)胞定位啟動子及配套的不同強(qiáng)度熒光蛋白，這使得即使目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量較低，也能夠被清晰地觀察到。
? 高侵染能力的農(nóng)桿菌突變體，增加瞬時蛋白表達(dá)量
? 高效表達(dá)異源蛋白的煙草及擬南芥突變體；可以在活細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)時觀察，避免了因處理過程對細(xì)胞造成的損傷和改變。
? 實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)豐富：專注于植物細(xì)胞樣本分析
實(shí)驗(yàn)流程
服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)說明
1. 浦芥免費(fèi)為客戶提供亞細(xì)胞定位預(yù)測服務(wù)，常用預(yù)測軟件Cell-PLoc、DeepLoc - 2.1及TargetP - 2.0。
軟件鏈接： http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/
https://services.healthtech.dtu.dk/services/DeepLoc-2.1/
https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP-2.0/
Reference:
Kuo-Chen Chou and Hong-Bin Shen, "Cell-PLoc: A package of web-servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms", Nature Protocols, 2008, 3, 153-162.
Practical Applications of Language Models in Protein Sorting Prediction: SignalP 6.0, DeepLoc 2.1, and DeepLocPro 1.0, pp. 153-175 of Dukka B. KC (ed.): Large Language Models (LLMs) in Protein Bioinformatics (MIMB, volume 2941), 2025
José Juan Almagro Armenteros, Marco Salvatore, Ole Winther, Olof Emanuelsson, Gunnar von Heijne, Arne Elofsson, and Henrik Nielsen. Life Science Alliance 2 (5), e201900429. doi:10.26508/lsa.201900429 (Open access)
2. 浦芥建立的豐富的亞細(xì)胞定位載體資源，包含了基于綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白的亞細(xì)胞定位載體庫，方便選擇使用。亞細(xì)胞定位載體選擇參見 《浦芥生物亞細(xì)胞定位可用載體列表》。
浦芥生物亞細(xì)胞定位可用載體列表
3. 浦芥具有各類細(xì)胞器定位的Marker載體，包括細(xì)胞核、細(xì)胞膜、葉綠體、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、自噬小體、過氧化酶體、線粒體等，部分Marker還有多種熒光蛋白，以方便共定位時選擇。共定位可用的細(xì)胞器Marker參見 《浦芥生物共定位可用的細(xì)胞器Marker列表》。
浦芥生物共定位可用的細(xì)胞器Marker列表
4. 為保證煙草轉(zhuǎn)化效率，本公司不接受客戶提供的農(nóng)桿菌?？蛻羧缬刑厥鈾z測要求，雙方協(xié)商具體服務(wù)事項(xiàng)。亞細(xì)胞定位技術(shù)服務(wù)內(nèi)容包括：亞細(xì)胞定位預(yù)測、基因克隆、載體構(gòu)建與驗(yàn)證、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、侵染、共聚焦顯微鏡觀察拍照。各項(xiàng)目可整體檢測也可單獨(dú)檢測。
5. 收費(fèi)方式：后付費(fèi)，零預(yù)收費(fèi)啟動項(xiàng)目。亞細(xì)胞定位和共定位有熒光信號就收費(fèi)，沒有熒光信號不收費(fèi)。待項(xiàng)目完成數(shù)據(jù)交與客戶認(rèn)可后，30日內(nèi)開具發(fā)票，轉(zhuǎn)賬付費(fèi)。
6. 結(jié)果確認(rèn)。客戶收到本公司的結(jié)題報(bào)告后，請務(wù)必在7日內(nèi)確認(rèn)結(jié)果，如有問題及時反饋售后人員，到期如無異議，默認(rèn)該項(xiàng)目成功。
7. 本合作僅限于為科研單位或個人提供亞細(xì)胞定位技術(shù)服務(wù)，所交付的產(chǎn)物僅作為實(shí)驗(yàn)室的研究材料使用，不具備商業(yè)用途，合作雙方應(yīng)在國家相關(guān)法律法規(guī)允許的范圍內(nèi)使用，違者對產(chǎn)生的后果自行負(fù)責(zé)，本公司不承擔(dān)任何連帶責(zé)任。
客戶提供材料
1. 目的基因序列，名稱等注釋信息，如果特別要求請?jiān)趥渥⒅凶⒚鳎?/span>
2. 如客戶需提供質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度為>100ng/μl，熒光蛋白的顏色或者激發(fā)光和發(fā)射光波長等信息；
3. 盡可能詳細(xì)的填寫“亞細(xì)胞定位服務(wù)登記表”，發(fā)送至售前銷售的微信 15301627726 或郵箱 sales01@pujiebio.com；
反饋客戶結(jié)果
1. 客戶委托本公司構(gòu)建載體，項(xiàng)目結(jié)束后提供構(gòu)建好的載體及相關(guān)測序結(jié)果。
2. 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。每個載體提供三組圖片數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)包括熒光亞細(xì)胞定位圖，DIC圖和Merge圖；如果是亞細(xì)胞共定位，每組數(shù)據(jù)包括熒光亞細(xì)胞定位圖，細(xì)胞器Marker熒光定位圖，DIC圖和Merge圖。
3. 提供包含詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟、分析整理圖片結(jié)果的結(jié)題報(bào)告，以及亞細(xì)胞定位的原始圖片。《亞細(xì)胞定位技術(shù)服務(wù)結(jié)題報(bào)告-模板》【注：此模板僅供參考】
案例展示
【備注：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)側(cè)廣泛分布，是一個連續(xù)的膜系統(tǒng)，從核膜一直延伸到細(xì)胞膜，廣泛分布，結(jié)構(gòu)較為分散。高爾基體分布在細(xì)胞核膜附近，是由膜囊堆疊形成的較為集中的結(jié)構(gòu)，膜比較有規(guī)律，數(shù)量較少。但植物細(xì)胞由于中央大液泡的影響，會將細(xì)胞內(nèi)的成分推擠到更靠近細(xì)胞膜的地方，因此有些高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白觀察到有點(diǎn)類似于細(xì)胞膜、細(xì)胞核的定位。如果要具體確認(rèn)定位，則需要做高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位?！?/span>
常見問題及解析（Q&A）
Q：構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體時，目標(biāo)蛋白連在熒光蛋白的N端更好，還是C端更好？
A: 大部分文獻(xiàn)一般都是把目標(biāo)蛋白連在N端，GFP放在C端；如果目標(biāo)蛋白連在C端，在加工過程中有可能信號肽 會連同GFP一起被切掉 ，導(dǎo)致熒光淬滅，或熒光信號弱。也有少部分目標(biāo)蛋白必須連在C端才有信號。極少的目標(biāo)蛋白需要連入GFP中間才有信號。融合在熒光蛋白N端的目標(biāo)蛋白一般無法得到過氧化物酶體的定位結(jié)果，融合在熒光蛋白C端的目標(biāo)蛋白一般無法得到線粒體、質(zhì)體的定位結(jié)果。選擇融合位置時需考慮蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能，有時可能需要嘗試兩種方式以確定最佳融合位點(diǎn)。
Q：為什么亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果和預(yù)期不符？
A: 不同物種或品種的植物細(xì)胞在翻譯表達(dá)基因時，其表達(dá)模式和影響因子不同。建議實(shí)驗(yàn)時盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進(jìn)行表達(dá)。不同時間點(diǎn)取樣拍照，定位位置不同。活體細(xì)胞狀態(tài)下，某些蛋白有信號肽，會移動。部分蛋白在特定條件（如缺氧）下會發(fā)生亞細(xì)胞定位改變，需查閱文獻(xiàn)確認(rèn)正常定位。GFP等標(biāo)記物融合位置（N端/C端）可能改變定位結(jié)果，需根據(jù)蛋白序列調(diào)整融合策略。有些預(yù)期不符的情況可能是由?儀器分辨率限制的，低分辨率儀器可能無法區(qū)分相鄰亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞膜）；?熒光波長與儀器不匹配會導(dǎo)致信號檢測偏差，需更換標(biāo)記物或調(diào)整儀器設(shè)置。建議優(yōu)先排查實(shí)驗(yàn)操作問題，若仍無法解決則需考慮蛋白自身特性或物種差異。查閱數(shù)據(jù)庫信息或者參考文獻(xiàn)，明確靶蛋白的定位情況，設(shè)置空白對照。
Q：為什么不同的受體材料有時得到的定位結(jié)果不一樣？
A: 不同物種或品種的植物細(xì)胞在翻譯表達(dá)基因時，其表達(dá)模式和影響因子不同。受物種差異的影響，同一個載體在不同的受體材料中表達(dá)的位置可能不同。建議實(shí)驗(yàn)時盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進(jìn)行表達(dá)。
Q：已知一個基因，其翻譯的蛋白很可能是分泌蛋白，用煙草做亞細(xì)胞定位的話，后期需不需要做質(zhì)壁分離處理？如果需要，應(yīng)該怎么做？
A: 當(dāng)目標(biāo)蛋白為分泌肽或含信號肽結(jié)構(gòu)，預(yù)測定位于細(xì)胞外基質(zhì)時，可先做初步定位，觀察其是否存在胞質(zhì)彌散或細(xì)胞邊緣聚集的定位情況，也可對分泌蛋白進(jìn)行監(jiān)測?，分別在侵染后24h、48h、72h取樣，觀察熒光從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)→高爾基體→囊泡的動態(tài)遷移?。如有，可追加質(zhì)壁分離驗(yàn)證；對于明確為胞內(nèi)細(xì)胞器定位的蛋白則無需質(zhì)壁分離。
?質(zhì)壁分離的最佳處理時間?是在熒光蛋白充分表達(dá)后（農(nóng)桿菌注射后48-72小時）進(jìn)行，過早處理易因蛋白表達(dá)不足導(dǎo)致信號微弱。
?【操作流程】：① ?葉片處理?：切取表達(dá)熒光融合蛋白的煙草葉片（約1cm2）。② 浸入 ?0.5–0.8 M蔗糖溶液?（高滲液）中，避光孵育10-15分鐘。③? 顯微觀察?：將葉片置于載玻片上，加蓋玻片輕壓，激光共聚焦顯微鏡下觀察。?原生質(zhì)體與細(xì)胞壁分離形成空隙表明質(zhì)壁分離成功。?④ 定位判定熒光信號位于空隙處（質(zhì)外體），或附著于收縮的原生質(zhì)體（膜結(jié)合）。
【注意事項(xiàng)】：① 質(zhì)壁分離會破壞細(xì)胞膜完整性并改變蛋白分布環(huán)境，而分泌蛋白的定位需在活細(xì)胞或接近生理狀態(tài)下觀察，以保持其動態(tài)分泌過程的真實(shí)性。實(shí)驗(yàn)處理不當(dāng)會導(dǎo)致細(xì)胞破裂或死亡，熒光信號彌散。因此?蔗糖濃度需要優(yōu)化，蔗糖處理時間嚴(yán)格控制在10-15分鐘。② 滲透脅迫可誘導(dǎo)蛋白錯誤定位（如應(yīng)激蛋白向膜遷移）?，應(yīng)該進(jìn)行關(guān)鍵對照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，觀察排除。③ 為避免細(xì)胞邊緣聚集的蛋白被誤判為膜定位，可通過細(xì)胞收縮后觀察熒光是否隨細(xì)胞膜移動來區(qū)分，也可與膜定位marker共定位。?同時也要連續(xù)掃描同一細(xì)胞區(qū)域（間隔5-10分鐘），確認(rèn)信號無彌散或偏移，從而對定位穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。?
Q：為什么要提供GFP空載的對照圖片？
A: 作為整個實(shí)驗(yàn)過程中的操作參照，可排除因?qū)嶒?yàn)操作而導(dǎo)致目的基因沒有熒光信號的影響。作為載體體系的參照，確認(rèn)構(gòu)建載體時所使用的載體是可正常表達(dá)熒光蛋白的。
Q：GFP是細(xì)胞全局定位，如果連入基因后跟GFP定位一樣，是否這種定位無意義？
A: 這種定位只能說和GFP一樣，但為了說明蛋白某種功能，必須在需要行使功能的細(xì)胞器里有定位；如果全局都有，證明起碼這個蛋白是能行使功能的，GFP一般不影響蛋白的亞細(xì)胞定位。
Q：拍攝時為什么有明場通道？
A: 顯示細(xì)胞狀態(tài)，有活力的細(xì)胞應(yīng)該有正確且明顯的細(xì)胞形態(tài)，變形或破碎的細(xì)胞說明此時細(xì)胞不是最適狀態(tài)或細(xì)胞已死亡。顯示熒光確實(shí)是細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的，而不是細(xì)胞碎片及雜質(zhì)產(chǎn)生的雜光。
Q：如何解釋蛋白質(zhì)在多個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中定位？
A: 蛋白質(zhì)可能在不同條件下或發(fā)育階段中具有不同的功能，因此可能存在于多個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。這可能需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，如條件變化下的重復(fù)實(shí)驗(yàn)或使用特定抑制劑，來驗(yàn)證蛋白質(zhì)的動態(tài)定位。
Q：熒光信號弱或不穩(wěn)定，如何改善？
A: 優(yōu)化蛋白表達(dá)啟動子，增加翻譯增強(qiáng)子，或添加高效的5`UTR（對部分蛋白，可提高蛋白表達(dá)量），或嘗試不同的轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)化煙草培養(yǎng)條件，確保培養(yǎng)條件穩(wěn)定，避免光照和溫度的劇烈變化；提高侵染農(nóng)桿菌的濃度。
Q：如何避免熒光淬滅？
A: 使用抗光漂白的熒光蛋白變體，如EGFP，以及在實(shí)驗(yàn)過程中盡量減少光照時間，使用低功率光源，可以減少熒光淬滅。
Q：對基因做定位預(yù)測后，是否可以直接做共定位？
A: 不同的預(yù)測網(wǎng)站有不同的計(jì)算方法，同一個基因在不同的預(yù)測網(wǎng)站也可能得出不同的定位結(jié)果。另外所有的結(jié)果都應(yīng)是基于實(shí)驗(yàn)得到的，對于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推薦先做普通定位，根據(jù)普通定位的結(jié)果再決定做哪種細(xì)胞器的共定位。
Q：共定位系數(shù)假陽性什么原因？
A: 通道串色或過曝。嚴(yán)格設(shè)置單標(biāo)對照，降低激光功率或增益。
Q：細(xì)胞死亡或形態(tài)異常是什么原因？
A: 侵染操作不當(dāng)或熒光蛋白過表達(dá)。應(yīng)減少質(zhì)粒用量，降低農(nóng)桿菌濃度，嚴(yán)格按照侵染步驟操作。
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